| dc.description | En el Palmar del Oriente, en el año 1994, en pleno ataque de la enfermedad pudrición de cogollo, se observaron unas palmas con una sintomatología diferente, presentaban secamientos en algunas hojas medias y bajeras, además de la pérdida de brillo y pudrición en los frutos de los racimos maduros y en ocasiones en racimos verdes; inicialmente se creyó que era una variante de la sintomatología conocida, pero después, mientras las palmas con pudrición se recuperaban y aquellas morían, por recomendación de la doctora Esther Ruiz, viróloga de un instituto cubano, se tomaron muestras de tejido del bajo meristemo y de las flechas, las mismas que fueron remitidas al Ciat para someterlas a un análisis con microscopia electrónica; los resultados mostraban la presencia de un microorganismo que, en ese momento, se denominó un micoplasma. Los casos con esta sintomatología dejaron de presentarse, pero en el año 2000 aparecieron nuevamente, aunque muy pocos; ya en añosos años 2002 y 2003 surgieron una gran cantidad de casos en las siembras 87 material Avros X Deli. Se procedió a tomar muestras de tejido, con el fin de determinar qué tipo de microorganismo estaba presente. Se hicieron aislamientos de 102 muestras de diferentes tipos de tejido de las palmas, meristemo, hojas y raíces bajo meristemo; y aunque se detectaron diferentes tipos de bacterias, al realizar pruebas con plántulas de previvero no se detectó ninguna patogénica. Se amplificaron muestras de ADN de palmas sanas e infectadas, así como de malezas presentes en los lotes afectados, mediante PCR directo y PCR-anidado. Para la primera amplificación se utilizaron las parejas de cebadores P1/P7 o R16mF2/R16mR1 bajo las siguientes condiciones: 100 ng de ADN, 1X buffer, 3mM MgCl2, 0.8 mM dNTPs, 0.1 ?M de cada cebador y 1U Taq polimerasa (CIAT). Para el uso de los cebadores P1/P7 se realizaron 35 ciclos en un termociclador PTC-100 bajo las siguientes condiciones: 30 seg. (90 seg. para el primer ciclo) de denaturación a 94ÚC, apareamiento por 50 seg. a 55°C, y extensión del cebador por 80 seg. (10 min. en el ciclo final) a 72ÚC; para los cebadores R16mF2/ R16mR1 se realizaron 28 ciclos, utilizando de igual forma las otras condiciones. Los productos de PCR fueron diluidos 1:50 con agua destilada estéril, para utilizarlos como ADN molde, en cantidad de 1?l, en el PCR anidado. Este PCR se amplificó con las parejas de cebadores R16F2n/R16R2 y Fu5/Ru3, con una temperatura de alineamiento de 50ÚC y 53°C, respectivamente. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% para visualizar las bandas. Para determinar el grupo de fitoplasma con el fin de clasificarlos, los fragmentos amplificados fueron digeridos con las enzimas de restricción MspI, AluI y TaqI. Se tomaron 5.4 ml del producto de PCR y se adicionaron 2 ml del tampón de la enzima 10X y 0.6 ml de la enzima de restricción (500 unidades/?l) y se completó con agua a un volumen final de 20 ?l. Se incubó esta suspensión durante 16 horas a 37 °C (la enzima TaqI se incubó a 65 ºC), luego se le adicionaron 3 ml de buffer de carga (Azul de Bromofenol 0.25%, Glicerol en agua al 30%) y se corrió la electroforesis en Synergel a 6 h a 100 V ? 24 mA en tampón de TBE 1X, tiñendo el gel en bromuro de etidio de 10 mg/ml. | es-ES |
